傷口愈合測定是一種研究體外細(xì)胞遷移的簡單方法。ibidi Culture-Insert 傷口愈合插件系列產(chǎn)品為傷口愈合實(shí)驗(yàn)提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需四個(gè)步驟。

　　本應(yīng)用是使用ibidi Culture-Insert 2 Well傷口愈合插件分析MCF-7細(xì)胞遷移的詳細(xì)方案。

圖 1. 使用ibidi Culture-Insert 2 Well行傷口愈合測定的實(shí)驗(yàn)工作流程

　　實(shí)驗(yàn)操作流程：

　　步驟1:細(xì)胞接種

　　為建立可靠的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，須在實(shí)驗(yàn)開始前確定實(shí)驗(yàn)參數(shù)。例如：選擇正確的細(xì)胞接種密度。我們建議使用24小時(shí)后產(chǎn)生百分之100光學(xué)融合細(xì)胞層的密度。

　　1.像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟，以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至約3x105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度，以在24小時(shí)后獲得融合的細(xì)胞層。

　　2. 將70µl細(xì)胞懸液滴入培養(yǎng)皿2孔插件的每個(gè)孔中。避免搖晃µ-Dish培養(yǎng)皿，因?yàn)檫@將導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

　　3. 將細(xì)胞在37°C和百分之5 CO2下培養(yǎng)至少24小時(shí)。

圖2. 在高壁預(yù)置傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞

　　步驟2:劃痕形成

　　融合細(xì)胞層是開始該測定的先決條件。移除高壁傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充抑制或增強(qiáng)物質(zhì)，以評估其對細(xì)胞遷移行為的影響。

　　1. 24小時(shí)后在顯微鏡下檢查細(xì)胞密度。如果24小時(shí)后仍未形成細(xì)胞融合層，則將µ-Dish培養(yǎng)皿再次放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)12-24小時(shí)。定期檢查匯合處。

　　2. 用無菌鑷子輕輕取出傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿。如圖3所示，用鑷子輕輕夾住插件的一角取出插件。

圖3.使用無菌鑷子移除傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿

　　3.移除插件后，檢查細(xì)胞層是否仍附著在μ-Dish培養(yǎng)皿的表面。

　　4.用無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS清洗細(xì)胞層，去除細(xì)胞碎片和未附著的細(xì)胞。

　　5.推薦使用體積為2mL的無細(xì)胞培養(yǎng)基填充μ-Dish培養(yǎng)皿。

圖4. 由高壁預(yù)置傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿創(chuàng)建的無細(xì)胞間隙

　　步驟3：獲取顯微鏡圖片：

　　我們建議錄制延時(shí)視頻，以確定時(shí)間依賴性和細(xì)胞遷移的特征。

　　1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動，直到圖像中捕捉到間隙和兩個(gè)細(xì)胞的正面。使用4x/5x或10x物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

　　2. 在接下來的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，通過多次拍攝圖像開始觀察過程。

　　3. 以30分鐘的時(shí)間間隔對在ibiTreat表面上培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行20小時(shí)的時(shí)間推移測量。

圖5.使用MCF-7細(xì)胞的遷移測定的時(shí)間流逝測量

　　步驟4：使用FastTrack AI和數(shù)據(jù)解釋進(jìn)行定量圖像分析

　　必須分析顯微照片以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以通過使用ibidi提供的傷口愈合快速通道人工智能圖像分析進(jìn)行自動圖像分析。

　　這里顯示的示例數(shù)據(jù)是使用FastTrack AI進(jìn)行分析的。自動圖像分析檢測細(xì)胞覆蓋面積。繪制細(xì)胞覆蓋面積隨時(shí)間的變化圖，顯示間隙閉合的過程。線性相位可以用來表征遷移(=傷口閉合的速度)。

　　線性相的斜率顯示，劃痕閉合的平均速度為0.0184*106µm2/小時(shí)（=0.44*106µm2/天）。

圖6. FastTrack AI對傷口愈合實(shí)驗(yàn)的定量圖像分析

　　高壁預(yù)置傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿放置在細(xì)胞培養(yǎng)表面上，提供兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)庫，每個(gè)庫由一條500μm壁隔開。在兩個(gè)儲液庫中填充細(xì)胞懸浮液僅允許細(xì)胞在設(shè)置區(qū)域生長。移除培養(yǎng)插件在適當(dāng)?shù)募?xì)胞附著后，產(chǎn)生大約500 μm的無細(xì)胞間隙。

　　在顯微鏡評估傷口愈合過程。根據(jù)您感興趣的焦點(diǎn)，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時(shí)間點(diǎn)觀察圖像來完成。測量細(xì)胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細(xì)胞遷移特征。