在趨化性細(xì)胞遷移后，可通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色研究定向細(xì)胞遷移的形態(tài)學(xué)特征。ibidi µ-Slide Chemotaxis細(xì)胞趨化載玻片可對嵌入的HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）進(jìn)行免疫熒光染色的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案。

µ-Slide 細(xì)胞趨化載玻片

　　一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：

　　二、實(shí)驗(yàn)步驟：

　　將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種在百分之五十的Matrigel®中，并填充至細(xì)胞趨化載玻片中，然后將其沿百分之十的FCS梯度遷移二十四個(gè)小時(shí)。采用免疫染色法觀察內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel®中定向遷移后的形態(tài)學(xué)特征。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的染色是直接在µ-Slide細(xì)胞趨化載玻片中進(jìn)行的。

　　1) 從一邊儲液池中取出塞子，然后吸出培養(yǎng)基。在抽吸和沖洗步驟中，將塞子留在中央通道中。

　　2) 用1x PBS洗滌

　　3) 用百分之四的多聚甲醛固定細(xì)胞和基質(zhì)蛋白

　　4) 重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作過程2的步驟

　　5) 用百分之零點(diǎn)二的riton X-100 / PBS透化細(xì)胞

　　6)  繼續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作過程2的步驟

　　7) 用百分之一的BSA/PBS阻斷非特異性抗原→過夜

　　8) 繼續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作過程2的步驟

　　9) 添加一抗：單克隆抗VE鈣黏著蛋白，小鼠在四攝氏度下1x 24小時(shí)

　　10) 繼續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作過程2的步驟

　　11) 添加二抗：山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 680→在四攝氏度下過夜

　　12) 繼續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作過程2的步驟

　　13) 加入染色混合物

　　i) 羅丹明phalloidin染色肌動(dòng)蛋白絲

　　ii) Hoechst 33342對細(xì)胞核染色

　　14) 繼續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作過程2的步驟

　　15) 將最后的PBS留在儲液罐中并開始成像。

　　免疫熒光圖像是由共聚焦激光掃描顯微鏡獲得，配以水物鏡。

　　重要提示：與標(biāo)準(zhǔn)染色方案相比，洗滌和染色步驟所需的培養(yǎng)時(shí)間更長。這是為了確保抗體通過凝膠充分?jǐn)U散。

　　三、細(xì)胞樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel®基質(zhì)中的免疫染色顯示，相鄰的細(xì)胞組優(yōu)先形成細(xì)胞簇并作為集合體遷移。少數(shù)細(xì)胞呈單細(xì)胞遷移。　　

　　圖中顯示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在百分之五十的Matrigel®中的多細(xì)胞趨化性的細(xì)胞簇。固定后，對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核藍(lán)色、F-肌動(dòng)蛋白紅色和VE鈣粘蛋白青色等進(jìn)行染色。白色箭頭表示VE介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸。

　　當(dāng)細(xì)胞作為個(gè)體遷移時(shí)，細(xì)胞體被拉長，呈間充質(zhì)梭形。細(xì)胞呈前后極性，前緣呈小片狀，向梯度方向有突起。當(dāng)以多細(xì)胞單元組織時(shí)，細(xì)胞團(tuán)簇表現(xiàn)出明顯的前后不對稱的群極化。在這里，一個(gè)或幾個(gè)前導(dǎo)細(xì)胞參與了前緣的形成，前緣表現(xiàn)出細(xì)長的突起或?qū)挼钠瑢?。遷移復(fù)合體較深區(qū)域的連續(xù)細(xì)胞沒有極化。然而，這些細(xì)胞特征性地保留了VE鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸。